创造性酶切

⑴ 限制性酶酶切DNA有几种方式

第一、二、三类，其中常用为第二类限制性内切酶，酶切活性在正常条件下只有一种，在非正常条件如浓度过大、非最适温度、离子条件不适宜时，会表现出非正常酶切活性，即切点发生变化，即星活性。

⑵ 常用的酶切有哪些方法

常用的酶切方法有单酶切、双酶切和部分酶切等几种。（1）单酶切法：这是用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同。若DNA样品本来就是线形DNA片段，完全酶切的结果，产生n+1个DNA片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端。

（2）双酶切法：这是用两种不同的限制性内切核酸酶酶切同一种DNA分子的方法。DNA分子无论是环状DNA分子，还是线形DNA片段，酶切结果，DNA片段的两个黏性末端是不同的（用同尾酶酶切除外）。环状DNA分子完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和。线形DNA片段完全酶切的结果，产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和加1。

（3）部分酶切：部分酶切指选用的限制性内切核酸酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的酶切。导致部分酶切的原因有底物DNA的纯度低、识别序列的甲基化、酶用量不足、反应时间不够以及反应缓冲液和温度不适宜等。部分酶切会影响需要的DNA片段的得率。但是从另一方面说，有时根据重组DNA的需要，还专门创造部分酶切的条件，以获得需要的DNA片段。

图4-2：DNA酶切电泳图

⑶ DNA的限制性酶切及电泳分析实验方法.

1. 反应体系的建立：⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：�无菌双蒸水 7 μl�10×酶切缓冲液 2 μl�质粒DNA(100 ng/μl) 10 μl�EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl�总体积为20μl⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。2. 37 ℃水浴1 h。3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。6 结果观察。操作注意事项：1. 吸样量一定要准确2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3. 要求在冰上操作，并充分混匀，4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1. DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活;②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等;③非限制性内切酶最佳反应条件;④酶切位点被修饰;⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。2. DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确;②DNA不纯或反应条件不佳;③酶切位点被修饰;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。3. DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力;②存在第二种限制性内切酶污染;③样品DNA中含有其它DNA。 可以到生物帮上查找这方面的信息啊，那里拥有生物领域内丰富的资源，有空的话，可以去 www.bio1000.com/zt/dna/164670.html 那里看下啊。

⑷ DNA限制性内切酶酶切的影响因素

当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。
若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

⑸ 限制性内切酶切割DNA双链后 可产生哪些切口 各有什么特点

当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况：
a：沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端；
b：在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。 例如:EcoRI限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端（之间可以根据碱基互补配对原则重组）
限制酶的切口不都是一长一短的, 一长一短的叫黏性末端,一样长的叫平末端.

⑹ dna限制性内切酶酶切时，有哪些注意事项

1)购买的限制性内切酶 带有两种不同的酶切缓冲液，该用哪一种
每种限制性内切酶 带有一管酶的最适反应液(通常是一种4-CORE反应液)，可能还带有一只MULTI-CORE反应液。

⑺ 酶切的基本步骤

1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性)，不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。
2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。
3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有
4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定 10-20ul就可以了。
5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。
详细的方法可以到生物帮上面了解下，丁氧基肼基甲酸酯保护性氨基酸单体及衍生物

⑻ 限制性核酸内切酶切割的原理和方法是什么

限制性核酸内切酶切割的原理：限制性核酸内切酶作用于双链DNA的磷酸二酯键，这种酶能识别特定的碱基序列，并且有特定的切割位点。

不同的限制性内切酶作用方式都不一样。不过大体来说，限制性内切酶都能够特异性识别并结合核酸的特殊反向回文序列（Inverted repeat palindromes ），然后催化断裂核苷酸链。

⑼ DNA限制性内切酶酶切的DNA限制性内切酶酶切原理

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
示意图：
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'