❶ 如何筛选和鉴定生物标本中差异表达的蛋白分子
目前筛选差异表达基因的方法主要有差异显示PCR方法 (differentialdisplayRT PCR ,DDRT PCR)、消减杂交法 (subtractivehybridization ,SH )、基因芯片技术 (DNAchiptechnique)和基因表达的系统分析 ( ,SAGE)等 ,其中消减杂交法中又先后建立了代表性差异分析技术 ( ,RDA)、抑制消减杂交法 ( ,SSH)和获得全长基因的消减杂交法 (full length gene ) .筛选差异表达蛋白质的方法主要有双向电泳技术(two dimentionalgelelectrophoresis)和噬菌体全套抗体库技术 ()
❷ 谁来介绍下phage display技术
一、单链丝状噬茁体展示系统
1．pIII展示系统及噬苗体抗体
丝状噬茵体是单链DNA病毒，pIII是病毒的次要外完蛋白(minor coatprotein)、位于病
毒颗粒的一端，每个病毒颗粒都有3—5个拷贝pIII蛋白，pIII有两个位点可供外源序列插入，即N端和近N端可伸屈胃内。当抗体片段或蛋白质融合到PIII的N端时，噬菌体仍有感染性，但若融合到后一位点则会切去N端而丧失感染性，这时就需有辅助噬菌体提供野生型pIII蛋白。PIII很容易为蛋白水解酶水解。所以有辅助噬菌体超感染时．可以使每个噬菌体平均显示不到一个融合蛋白，即所谓“单价“噬茵体，从而使抗体部分最大限度地保持原构型而功能完好。
PIII展示系统的主要用途是制备噬茵体抗体，它的突出优点是模拟了自然免疫选择系统。自然免疫系统(immune system)(immune system)中．抗原结合于B细胞表面受体而使其活化并分裂增殖、分化成有抗体分泌功能的浆细胞。这个过程可以从约5×109个鼠细胞和约1012人细胞中选出一个至几个特异B细胞，并有选择性地富集特异性B细胞，通过多轮突变和选择使抗体亲和力成熟。pIII展示系统完全模拟了自然选择系统；噬菌体展示的抗体片段可以由抗原包被的板、柱等选择，或者用生物素标记的抗原从液相中捕获。结合在固相抗原的噬茵体抗体经洗涤后可用可溶性半抗原、酸、碱等洗脱，然后感染大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)培养扩增，再经下一轮的“吸附—洗脱—扩增”筛选。首轮筛选可使特异性噬菌体富集20一1000倍，一般经4轮筛选，可富集107倍。对初步筛选的抗体，可以用错构酶及PCR锗配技术等实行多轮突变或采用链置换法使其亲和力成熟。
用P III系统制备抗体的基本程序是：从经免疫或未免疫者获取淋巴细胞(外周血淋巴细胞，或脾、淋巴结、骨髓等的淋巴细肥)，提取细胞mRNA(或细胞基因组DNA)，逆转录成cDNA，用PCR方法扩增抗体重链和轻链基因，若制备ScFv抗体片段，还需设计接头Linker，如（Gly4—Ser），做成VH—Linker—VL连接)。将扩增的抗体基因克隆到丝状噬茵体载体中，若欲制备ScFv抗体，则克隆VH—Linker—VL基因，若制备Fab抗体、则可将VHCHl基因克隆入λ菌体载体，轻链基因克隆入PASK22类型载体中，在大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)共表达，或将二者克隆入同一噬茵体载体中进行表达。P III展示系统的载体，在抗体基因与P III蛋白之间插入了一个琥珀中止密码(amber stop codon)，当此密码受抑制时抗体片段就展示在噬菌体表面，当此密码不受抑制时抗体则分泌。因此在抑制型和非抑制型大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)中培养重组噬菌体时就分别模拟了B细胞表面呈现抗体SmIg和浆细胞分泌抗体的功能。已有用P III展示系统成功地筛选到高亲和力特异性抗体的报道。
与杂交瘤技术相比，pIII展示系统筛选范围从几千扩增到几百万甚至几亿．而时间可以从几个月缩短到几周，它不但绕过了繁琐的杂交瘤技术．甚至可以绕过免疫，而且可以直接获取人源性抗体，解决了鼠单抗应用于人体免疫原性问题。
2．PVIII及其它展示系统
PVIII是丝状噬茵体主要衣壳蛋白(major Coat protein)，每个病毒颗粒有3000拷贝pVIII蛋
白。PVIII的N端附近可融合五或六肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多聚蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有辅助噬茵体参与时，可提供野生型pVIII蛋白．降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。
二、λ噬茵体展示系统
1，pV展示系统
λ噬菌体的主要尾部蛋白P v可供外源序列插入。λ噬菌体基因V编码的主要尾部蛋白
形成管状结构，由32个盘状结构组成，每个盘状结构又由6个Pv亚单位组成。Pv有两个折叠区〔fo1ding domain)，C端的折叠区是病毒的非功能区，可供外源序列插入或替换。Maruyama等用p v系统成功地展示了有活性的大分子蛋白：β—半乳糖苷酸(465KD)和植物外源凝集素BPA(120KD)。DNA结合蛋白、放多细胞质蛋白若融合进丝状噬菌体，将相互干扰由细菌细胞质到周质腔分泌的通道，而用λ噬菌体使其在细胞质中完成折叠，无需分泌，因此避免了这一干扰。λ噬菌体还可以展示难以分泌的肽或蛋白质，因此可作为丝状噬菌体展示系统的补充。
2．D蛋白展示系统。
D蛋白是λ噬菌体头部组装必需蛋白，分子量11KD。λ噬茵体颗粒的两个结构单位头部和尾部是分别组装的。在头部组装过程中先形成支架状前头，然后水解加工成前头，当DNA进人头部以后，D蛋白附着于病毒衣壳的外侧、将噬茵体头部锁住，使之围绕DNA就位，因此正常情况下，D蛋白在噬茵体头部形态发生上是必需的。但是当噬茵体基因组小于野生型基因组的82％时，它可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体。这种展示一般为N端展示。它的组装可以在体内，也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到λD—噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD—溶源的E．Coli菌株中从而补偿溶源茵所缺的D蛋白，通过热诱导而被组装，或利用噬菌体P1的Cre—loxP定点重组系统将外源基因整合进入噬茵体基因组中。
D蛋白展示系统的特点：因为是在病毒细胞内完成组装．无需将外源肽或蛋白分泌到细
菌细胞膜，可以展示对细胞有毒性的蛋白。另外，D蛋白展示系统还可以用于cDNA文库的构建，抗原位点分析及作为基甲输送工具。Mikawa等对D蛋白的基因进行了改
造，使外源序列在D蛋白的N端和C端都能插入，并成功地表面展示了有活性的葡萄球菌A蛋白IgG结合域、β—半乳糖昔酶和β—内酰胺酶。
三、T4噬茵体展示系统。
T4噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与T4噬菌体的小外衣壳蛋白(small outer capsid
protein SOC)C端融合而被展示。如SOC是一个分子量为9KD的小蛋白，是T4衣壳组装非
必需的，而且不论在体内还是体外，它都具有与成熟衣壳表面特定位点高亲和力地专一结合
的能力，T4噬菌体是在宿主细胞内组装而不必通过分泌途径，因此可以展示的败或蛋白质
范围广，尤其适用于展示那些不能被E．coli分泌的复杂蛋白质。
目前已成功地利用该系统展示了HIV—1病毒被膜糖蛋白gpl 20的v3环状结构域和脊
髓灰质炎病毒VPl衣完蛋白(312肽)，两者均能形成正确的折叠结构。由于该系统容量大
(至少35KD的蛋白质)、拷贝数高，故在完整结构域或蛋白质的免疫学展示、蛋白质与蛋白质问相互作用的研究及生物工程学方面有相当大的应用潜力。
现在有研究报道利用E.coli的脂蛋白、鞭毛蛋白展示外源蛋白。但是相对而言，革兰氏阳性菌比阴性的有优越性：G+细菌表面受体比G—细菌更易接受外源序列的插入；G—细菌展示系统的表面展示要穿过整个细胞质膜，需要膜上的正确整合过程，而G+细菌展示系统只需穿过单层膜就可以实现理想的展示；以细菌全细胞作为诊断或Panning实验，从巨大文库中筛选特异性细菌克隆的实际操作中，因为G+细菌有较厚的细胞壁(cell wall)(cell wall)，不容易在各种实验过程中发生细胞溶解。
回复:
❸ 简述检测蛋白质磷酸化的检测方法及其原理
方法及原理：
1.激酶活性分析
生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。
直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物，通过SDS-PAGE分离，并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育，且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳，这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。
2.WesternBlot
利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上（通常是PVDF或尼龙膜），之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化，研究人员常常利用一个抗体来检测同源蛋白的总水平（而不考虑磷酸化状态），以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。化学发光和显色法都很常用，而分子量marker常用来提供蛋白分子量的信息。
3.酶联免疫吸附分析（ELISA）
ELISA的定量能力优于Westernblot，且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品（如细胞裂解液）中的一个组分。加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。
4.基于细胞的ELISA
来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估，并比较多个样品，与传统免疫印迹中使用磷酸化特异和总蛋白抗体相似。这些分析绕过了制备细胞裂解液的需要，因此更适合高通量分析。
5.质谱
首先，磷酸化肽段的信号通常较弱，因为它们带负电荷，而电喷雾质谱在正电模式下作用，因此电离效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很难观察到低丰度目的蛋白的信号。
6.多个分析物图谱分析