創造性酶切

⑴ 限制性酶酶切DNA有幾種方式

第一、二、三類，其中常用為第二類限制性內切酶，酶切活性在正常條件下只有一種，在非正常條件如濃度過大、非最適溫度、離子條件不適宜時，會表現出非正常酶切活性，即切點發生變化，即星活性。

⑵ 常用的酶切有哪些方法

常用的酶切方法有單酶切、雙酶切和部分酶切等幾種。（1）單酶切法：這是用一種限制性內切核酸酶酶切DNA樣品。若DNA樣品是環狀DNA分子，完全酶切後，產生與識別序列數（n）相同的DNA片段數，並且DNA片段的兩末端相同。若DNA樣品本來就是線形DNA片段，完全酶切的結果，產生n+1個DNA片段數，其中有兩個片段的一端仍保留原來的末端。

（2）雙酶切法：這是用兩種不同的限制性內切核酸酶酶切同一種DNA分子的方法。DNA分子無論是環狀DNA分子，還是線形DNA片段，酶切結果，DNA片段的兩個黏性末端是不同的（用同尾酶酶切除外）。環狀DNA分子完全酶切的結果，產生的DNA片段數是兩種限制性內切核酸酶識別序列數之和。線形DNA片段完全酶切的結果，產生的DNA片段數是兩種限制性內切核酸酶識別序列數之和加1。

（3）部分酶切：部分酶切指選用的限制性內切核酸酶對其在DNA分子上的全部識別序列進行不完全的酶切。導致部分酶切的原因有底物DNA的純度低、識別序列的甲基化、酶用量不足、反應時間不夠以及反應緩沖液和溫度不適宜等。部分酶切會影響需要的DNA片段的得率。但是從另一方面說，有時根據重組DNA的需要，還專門創造部分酶切的條件，以獲得需要的DNA片段。

圖4-2：DNA酶切電泳圖

⑶ DNA的限制性酶切及電泳分析實驗方法.

1. 反應體系的建立：⑴ 在一無菌1.5 ml Eppendorf管中加入：�無菌雙蒸水 7 μl�10×酶切緩沖液 2 μl�質粒DNA(100 ng/μl) 10 μl�EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl�總體積為20μl⑵ 輕輕混勻，12000 rpm離心5 sec。2. 37 ℃水浴1 h。3. 將Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通過加熱使酶失活以終止反應。4. 12000 rpm離心5 sec，將管蓋及管壁上的水離下。5. 取10 μl消化產物，與2 μl 6×上樣緩沖液混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測消化效果，電泳條件：約100 V 30～60 min。6 結果觀察。操作注意事項：1. 吸樣量一定要准確2. 為了不使酶污染而導致浪費，最後才加酶3. 要求在冰上操作，並充分混勻，4. 開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防污染。5. 樣品在37 ℃與65 ℃保溫時，將離心管蓋嚴，以防水進入管內造成實驗失敗。限制性內切酶酶解中常見的問題和原因1. DNA完全沒有被限制性內切酶切割：①限制性內切酶失活;②DNA不純，含有SDS、有機溶劑、EDTA等;③非限制性內切酶最佳反應條件;④酶切位點被修飾;⑤DNA上不存在該酶的識別順序。2. DNA切割不完全：①限制性內切酶活性下降或稀釋不正確;②DNA不純或反應條件不佳;③酶切位點被修飾;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切後DNA粘末端退火。3. DNA片段數目多於理論值：①限制性內切酶星號活力;②存在第二種限制性內切酶污染;③樣品DNA中含有其它DNA。 可以到生物幫上查找這方面的信息啊，那裡擁有生物領域內豐富的資源，有空的話，可以去 www.bio1000.com/zt/dna/164670.html 那裡看下啊。

⑷ DNA限制性內切酶酶切的影響因素

當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時，會影響其進一步使用，因此在吸取限制性內切酶時，每次都要用新的吸管頭。如果採用兩種限制性內切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。
若兩者可用同一緩沖液，則可同時水解。
若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用，隨後調節鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成後，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻後置-70℃低溫冰箱30分鍾，離心、乾燥並重新溶於緩沖液後進行第二個酶切反應。

⑸ 限制性內切酶切割DNA雙鏈後 可產生哪些切口 各有什麼特點

當限制性內切酶作用於特定的DNA時，把這段序列沿著特定的切點切開的這個過程分兩種情況：
a：沿著中軸線切口（即沿著DNA雙鏈中對應的磷酸二酯鍵）切開，得到的就是兩個平末端；
b：在中軸線的兩端切口切開，得到的就是兩個黏性末端。 例如:EcoRI限制性內切酶就可以識別G/AATTC的DNA序列，然後在G和A間切開，得到的就是兩個黏性末端（之間可以根據鹼基互補配對原則重組）
限制酶的切口不都是一長一短的, 一長一短的叫黏性末端,一樣長的叫平末端.

⑹ dna限制性內切酶酶切時，有哪些注意事項

1)購買的限制性內切酶 帶有兩種不同的酶切緩沖液，該用哪一種
每種限制性內切酶 帶有一管酶的最適反應液(通常是一種4-CORE反應液)，可能還帶有一隻MULTI-CORE反應液。

⑺ 酶切的基本步驟

1) 成功酶切的關鍵是准備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機溶劑(會使酶變性或產生星號貨性)，不能含有干擾酶活性的污染物質，不能含有高濃度的EDTA (TE中的EDTA濃度較低，對Mg的濃度影響較小);同時要對DNA甲基化程度及其對酶切效率的影響要做到心中有數。
2) 選用合適的酶。根據酶切序列選用，特別注意選用甲基化對酶活性的干擾。
3) 正確使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低溫環境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來。運輸和臨時存放時需要將酶至於冰上。手拿酶管時不要接觸酶管下步含酶的部分，移酶時盡可能用長TIP, 避免污染。用完後需要及時送回原處。注意：酶通常是最後加。所有
4) 反應體積需要根據實驗目的定，常規的酶切一般要維持在10-50ul，酶切鑒定 10-20ul就可以了。
5) 模板濃度問題：濃度過高，溶液黏度過大，酶不能有效擴散，酶切效果不會好。濃度過低，也會影響酶活性。
詳細的方法可以到生物幫上面了解下，丁氧基肼基甲酸酯保護性氨基酸單體及衍生物

⑻ 限制性核酸內切酶切割的原理和方法是什麼

限制性核酸內切酶切割的原理：限制性核酸內切酶作用於雙鏈DNA的磷酸二酯鍵，這種酶能識別特定的鹼基序列，並且有特定的切割位點。

不同的限制性內切酶作用方式都不一樣。不過大體來說，限制性內切酶都能夠特異性識別並結合核酸的特殊反向迴文序列（Inverted repeat palindromes ），然後催化斷裂核苷酸鏈。

⑼ DNA限制性內切酶酶切的DNA限制性內切酶酶切原理

限制性內切酶能特異地結合於一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，並切割雙鏈DNA。它可分為三類：
Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴於ATP的存在。Ⅰ類酶結合於識別位點並隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然後從底物上解離。
Ⅱ類由兩種酶組成： 一種為限制性內切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的迴文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少數酶識別更長的序列或簡並序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列後產生兩個互補的粘性末端。
示意圖：
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'