銀染技術是誰發明的

Ⅰ 聚丙烯醯胺凝膠中核酸的銀染問題

是一種人工合成凝膠，是以丙烯醯胺為單位， 由甲叉雙丙烯醯胺交聯成的，經乾燥粉碎或加工成形製成粒狀，控制交聯劑的用量可製成各種型號的凝膠。交聯劑越多，孔隙越小。聚丙烯醯胺凝膠的商品為生物膠－P （Bio-Gel P），由日本tosoh的TSKGEL的pw系列，適合蛋白和多糖的純化。即丙烯醯胺和少量交聯劑甲叉雙丙烯醯胺，在催化劑過硫酸銨作用下聚合形成凝膠。
以下為《化工詞典》中的介紹：
聚丙烯醯胺;PAM;polyacrylamide
聚丙烯醯胺簡稱PAM、結構式為[－CH2－CH(CONH2)]n－，分子量100～ 500萬。聚丙烯醯胺主要有兩種商品形式，一種是粉末狀的，另一種是膠體，還有聚丙烯醯胺乳液(上海合成樹脂研究所研製)。易溶於冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯醯胺當濃度超過10％以後．就會形成凝膠狀結構。提高溫度可以稍微促進溶解，但溫度不得超過50℃，以防發生分子降解。難溶於有機溶劑。溫度超過120 ℃時分解。中性。無毒。
用作增稠劑、絮凝劑、減阻劑，具有凝膠、沉降、補強等作用。貯存於陰涼、通風、乾燥的庫房內，防潮、避光、防熱．存放時間不宜過長。
聚丙烯醯胺凝膠電泳;polyacrylamide gel electrophoresis;PAGE
用聚丙烯醯胺為支持基質的電泳程序。一般說來，實現聚丙烯醯胺凝膠電泳有兩種類型。(1)單向電泳：採用完整的蛋白質或用十二烷基磺酸鈉(SDS)處理的蛋白質的單向泳動，在有凝膠的平板上平行分離(過去也有用在玻管中的圓筒形棒狀凝膠進行電泳的，現已很少有人使用)。(2)雙向電泳：首先用天然蛋白質進行分離，然後凝膠平板再用SDS處理，樣品便在第二向得到分離。第一次分離了各種各樣的蛋白質，因此第二向分離的是蛋白質亞基。主要優點是：(1)合成聚合物，故重復性良好；(2)分離能力好；(3)通過增減丙烯醯胺單體和交聯劑(N,N′-亞甲基雙丙烯醯胺)的濃度，可以調節凝膠的孔徑大小；(4)操作簡便、時間短；(5)化學性質穩定、機械性能好，柔軟；(6)在酸性或鹼性緩沖液中均可進行電泳，而且可加入兩性電解質進行等電點電泳，可用含電解質表面活性劑(SDS)或非電解質表面活性劑(Np40、Tritonx-100等)的凝膠進行電泳，亦可使兩者組合進行雙向電泳等等，使用范圍廣泛，利用價值日益提高；(7)由於染色技術的進步，可以進行定量，也可檢測出極微量的斑點(瓊脂糖電泳)。
聚丙烯醯胺型絮凝劑;Magnifloc
聚丙烯醯胺（Polyscrylamide）簡稱PAM，分陽離子、陰離子型、非離子型，分子量從400-2000萬之間，產品外觀為白色粉末，易溶於水，溫度超過120℃時易分解。聚丙烯醯胺是一種合成高分子絮凝劑，俗稱西伯朗。屬於聚合電解質。它是目前鈾水冶廠浸出礦漿的固液分離過程(如逆流傾析-洗滌過程)中廣泛使用的絮凝劑，目的在於改善礦漿的澄清、沉降和過濾性能。
聚丙烯醯胺;2-丙烯醯胺均聚物;絮凝劑3號;Polyacrylamide;PAM;2-Propenamide, homopolymer
分子式：[C3H5ON]n
分子量：100-500萬
CAS號：9003-05-8
性質：無色或微黃色稠厚膠體。為水溶性樹脂，能以任何比例溶於水。僅在冰醋酸、丙烯酸、乙二醇、甲醯胺、甘油、乳酸等少數溶劑中能溶解1%左右，幾乎不溶於有機溶劑。溫度超過120℃時易分解。
制備方法：丙烯腈在銅催化劑作用下水合得到丙烯醯胺，再K2S2O8作用下聚合為聚丙烯醯胺。銅鋁合金經鹼處理水洗後製成崔化劑，裝入水合反應器中，丙烯腈原料抽至貯罐再放入計量罐中，離子交換處理後的純水送入計量罐中，然後按比例用泵經原料預熱器連續注入水合反應器，控制85-125℃進行水合反應生成丙烯醯胺水溶液，餘下丙烯腈經閃蒸塔去冷凝器回收流入水計量罐循環使用，而丙烯醯胺溶液從閃蒸罐流入貯罐，用泵送至高位槽去樹脂交換柱，進入貯槽配成7-8%濃度單體，送往聚合釜製成膠狀體聚丙烯醯胺包裝即為成品。
用途：廣泛應用於石油化工、冶金、煤炭、選礦和紡織等工業部門，用作沉澱絮凝劑、油田注水增稠劑、鑽井泥漿處理劑、紡織漿料、紙張增強劑、纖維改性劑、土壤改良劑、土壤穩事實上劑、纖維糊料、樹脂加工劑、合成樹脂塗料、粘合劑、分散劑等。

Ⅱ 端粒酶療法發明人是誰

端粒酶療法:是以抑制或激活端粒酶活性為手段的基因療法。主要是用反義核酸或核(ribozyme) 技術，抑制端粒酶在抗癌方面;激活端粒酶在延緩人類體細胞衰老方面的應用。

端粒酶，又稱端聚酶。端粒酶是一種自帶RNA 引物的逆轉錄酶。生殖細胞、造血幹細胞和腫瘤細胞含有較高的端粒酶活性。其活性可用聚合酶鏈反應(PCR) 技術擴增其酶促反應產物(即TRAP 法) ，然後輔以銀染法測定之。端粒酶的存在使染色體末端得以完全復制。染色體端區(telomere) ，又稱端粒。端區消失可能是人類細胞喪失復制能力的原因之一。端區是真核生物染色體末端的特殊結構。人類染色體末端普遍存在端區結構。人類染色體端區由進化上高度保守的DNA 重復序列TTAGGG組成，由端粒酶合成。

端粒酶療法，主要是用反義核酸或核酶(ribozyme) 技術抑制端粒酶活性，誘導惡性細胞分化與凋亡;激活端粒酶在延緩人類體細胞衰老等方面各有應用價值。端粒酶療法在醫學中極為重要，目前，是國內外醫學界研究熱點。端粒酶療法對腫瘤防治、診斷和延緩人類體細胞衰老等方面具有重要意義。

Ⅲ NOR銀染有什麼意義

有轉錄活性的NOR才能被銀染，所以可以用AgNOR的技術來研究rRNA基因的轉錄活性！

Ⅳ DNA測序技術的簡介

DNA測序技術，又叫基因測序技術。
人類基因組這部由A、T、G、C四個字母組成的卷帙浩繁的生命天書如同一座寶庫，保藏著幾千年來人們迫切想知道的秘密，DNA測序技術就好似「芝麻開門」這樣的咒語，是我們打開寶庫的金鑰匙世界上第一個測定DNA序列的方法是由英國生化學家弗雷德里克·桑格爾發明的。自此DNA測序的速度就一直呈加速態勢。2001年人類基因組草圖耗資4.37億美元，耗時13年。到了2007年，第一個完整人類基因組序列圖譜的誕生只花費了150萬美元，3個月就搞定。2009年1月2日，美國加州太平洋生物科學公司的科學家喬納斯·考爾拉赫、斯蒂芬·特納及其研究小組在《科學》雜志上發表論文稱，他們將納米技術與晶元技術相結合，發明了一種新型測序方法，速度是現有技術的3萬倍。 Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03-- 2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。

Ⅳ 什麼是SRAP標記技術其原理是什麼有哪些應用領域

the optimization of Srap tec-system and the application on analysis of genetic diversity of Chinese alligator
摘 要：基於PCR的分子標記技術很多，但均因自身缺點限制了發展和應用。
abstract：There're various technologies on PRC-molecular marker，whose development are all restrained by their inherited shortage.
一種新興的分子標記技術－相關序列擴增多態性SRAP以其特有的優點得到日益廣泛的應用，顯示了良好的發展前景。as it ows a sui genetic advantage,a new burgeoning molecular marker tecnologe --相關序列擴增多態性SRAP is widely applied. 此技術目前較多應用於植物材料的遺傳分析，本研究將通過對技術體系各影響因素進行調整，優化反應體系，比較DNA提取方法，調整銀染技術，得到很好的擴增效果。this teconology is used to applied to anlynasis the heredity of plant-material.Our research will modify the effective aspects to optimize the reaction system and modify the 同時對SRAP的原理、特點及其對浙江長興揚子鱷種群遺傳多樣性的分析進行了介紹。研究結果表明，SRAP同樣可以用於動物遺傳多樣性分析，為其保護提供分子支持。SRAP技術將成為研究領域一個有力的工具。暈 好累 幹活晚點繼續

Ⅵ 急求：有誰知道蛋白質電泳染色時的銀染配方呀謝謝你的幫助

我的配方如下，僅供參考：
1. 固定：30min或過夜
100ml 乙醇 40% 乙醇
25ml冰醋酸 10% 冰醋酸
加水到250ml
2. 致敏：30min
300ml 乙醇 30% 乙醇
68g 乙酸鈉（或112.8g 三水乙酸鈉）
2g硫代硫酸鈉
加水到終體積1000ml
3. 水洗：3 x 5min
4. 銀染：20min
0.625g AgNO3
加水到終體積250ml
5. 水洗： 2 x 1 min (准確掌握時間，水洗時間長顯色速度慢，點的顏色淺)
6. 顯色：視情況而定
6.25 g Na2CO3
100 ul 37% 甲醛 （在使用前加入）
可加入 1g/L Na2S2O3 50微升以降低背景（在使用前加入）
加水到終體積250ml

Sweet silver:
硼酸 3.1克 100 mM
NaOH 3 克 150 mM
加水到終體積500 ml。
用前取sweet 225 ml加1g/L Na2S2O3 200微升，40%葡萄糖25 ml。
7. 終止：10min
7.3g EDTA.Na2.2H2O 或者2g 甘氨酸
加水到終體積500ml
8. 保存：1% 冰醋酸，4 ℃

Ⅶ 花椰菜種質資源的創新是怎樣的

（一）廣泛引進國外花椰菜雜交品種自交分離創新種質資源

鑒於目前國內花椰菜種質資源貧乏的現狀，直接從國外引進優良一代雜種，通過自交分離、純化，從中篩選出優良的種質資源，是最經濟、有效的獲得新種質的方法。目前國內花椰菜育種單位利用該方法已分離了大批新的種質資源和自交系，並利用這些種質資源選育出許多優良的花椰菜新品種，如白峰、津雪88、雲山1號、豐花60、廈花6號等目前生產上推廣的絕大多數品種。

（二）種內雜交創造新類型

甘藍類蔬菜的不同亞種或變種間很容易雜交，因此可以通過種內雜交方法，創造優異的種質資源甚至創造新的物種。孫德嶺等（2002）採用花椰菜（白菜花）與青花菜、花椰菜與紫花菜、紫花菜與青花菜之間雜交。其後代花球的單球重大大提高，接近於花椰菜，色澤介於父本和母本之間，而維生素C的含量接近青花菜，比花椰菜提高22%～60.6%，全糖含量比青花菜增加9.8%～33.1%（表11-1），口味甜脆，品質和口感都優於其父本和母本，通過進一步選育有望選育出新的花椰菜類型，為花椰菜家族增加新的成員。

表11-1 花椰菜新類型全糖、維生素C含量

（三）生物技術與花椰菜種質資源創新

常規育種在花椰菜種質資源創新方面起了很大的作用，但通常存在能穩定遺傳的有益基因狹窄或缺乏；多數有益基因是由許多微效基因控制，且該類基因選擇較困難以及基因型差異難以確定等問題。隨著生物技術的發展，在傳統育種工作的基礎上，可以提高育種的針對性，克服常規育種中一些難於解決的問題，進一步拓寬有益種質資源的創新和利用。目前已經有越來越多的研究者注重應用生物技術進行種質資源的創新。

1.細胞工程與花椰菜種質資源創新

（1）花葯培養和游離小孢子培養技術 20世紀60年代初，Guha和Maheshwari開創了花葯培養誘導單倍體的方法。此後花葯培養成為誘導單倍體的重要途徑之一，並且在作物育種中得到應用。在花椰菜上，王懷名（1992）對嫩莖花椰菜花葯和花粉培養中的胚胎發生進行了研究，觀察了花葯中花粉粒發育成胚狀體的過程和再生植株染色體倍性。張小玲（2002）等研究認為，磁場預處理可明顯提高花葯培養愈傷組織的誘導率。陳國菊（2004年）以5個花椰菜品種為材料進行花葯培養，獲得再生植株，並得到了種子。

由於花葯培養的方法不能排除再生植株來自體細胞的可能性，多年來使花葯培養獲得再生植株的研究進展緩慢。而採用游離小孢子培養的方法可以很好地解決這一難題，因此，游離小孢子培養的方法獲得再生植株越來越受到重視。目前該技術已陸續在芸薹屬的大白菜、不結球白菜、結球甘藍、芥藍、抱子甘藍、羽衣甘藍、大頭菜、葉芥、蕪菁甘藍和花椰菜等蔬菜上獲得成功。北京農林科學院蔬菜研究工程中心、河南農業科學院園藝研究所、天津科潤蔬菜研究所等單位先後開展了花椰菜游離小孢子培養工作，初步建立了花椰菜游離小孢子培養技術體系，在一些品種中獲得了花椰菜DH株系，培育出花椰菜優良新品種。

通過游離小孢子培養可快速、有效地獲得DH純系。DH株系具有穩定的遺傳特性，並能從親本獲得隨機排列的配子，由於游離小孢子培養能快速純合雜合親本，因此對由多基因控制的特異性狀的篩選能一步到位，明顯提高了選擇幾率，加快育種進程。耿建峰等（2002）利用游離小孢子培養產生的兩個自交不親和系配製出具有早熟、耐熱、花球潔白、品質好和抗病性強等綜合性狀優良的花椰菜DH雜交種「豫雪60」，孫德嶺（2002）對引進的國內外育種資源材料461份，利用游離小孢子培養和常規技術相結合進行種質資源的創新和對DH株系材料進行評價及鑒定，選育出「津品50」。

游離小孢子培養技術也被應用於芸薹屬遠緣及種間雜交育種中。石淑穩等（1993）分別從甘藍型油菜與諸葛菜的屬間雜種，甘藍型油菜與白菜型油菜、甘藍型油菜和芥菜型油菜的種間雜種獲得游離小孢子胚和再生植株，為芸薹屬植物遠緣及種間雜交育種建立了種質資源創新的途徑。

（2）原生質體融合技術 原生質體融合也稱體細胞融合，是兩種原生質體的雜交，它不是雌雄配子間的結合，而是具有完整遺傳物質的體細胞之間的融合，它可打破種間、屬間存在的性隔離和雜交不親和性，從而廣泛地聚合各種優良的基因，使變異幅度顯著增大，創造新的種質資源。因而此項技術越來越受到遺傳育種學家的重視。自Carlson等在1972年獲得第一株煙草體細胞雜種植株以來，該技術體系不斷完善和發展，在許多物種上細胞融合獲得成功。20世紀80年代中期已報道有15個種內組合，38個種間組合，13個屬間組合獲得體細胞雜種植株，到90年代，通過體細胞雜交技術又添加了再生植株的種內雜種14個，種間雜種62個，屬間雜種47個，並有2個科間組合的胞質雜種分化獲得再生植株。在十字花科芸薹屬中已獲得融合雜種植株有：擬南芥油菜、甘藍油菜、甘藍+白菜型油菜、白菜型油菜+花椰菜。

原生質體融合技術與常規有性雜交的差別在於：體細胞雜交中沒有減數分裂，有兩個二倍體的細胞原生質體融合產生出四倍體的雜種植株，而用同樣的親本有性雜交則只產生二倍體雜種。

原生質體融合可以獲得細胞質雜種，為培育細胞質雄性不育、抗除草劑等花椰菜品種提供了一條育種新途徑。目前，通過有性雜交、回交轉育的花椰菜細胞質雄性不育類型主要是Ogura胞質雄性不育類型和Polima胞質雄性不育類型。而利用常規育種轉育年限一般需要6～11年，利用原生質體融合技術轉移細胞質雄性不育基因可以克服有性回交轉育所帶來的年限長或雜交不親和等問題，為花椰菜雜種優勢的有效利用開辟了新的途徑。惠志明（2005）進行了利用原生質體融合技術向花椰菜轉移Ogura蘿卜胞質雄性不育的研究，獲得了花椰菜與Ogura蘿卜胞質甘藍型油菜種間體細胞雜種植株。由此可見，原生質體融合技術已經應用於花椰菜不育性的研究領域，已獲得了大量的雄性不育轉育植株，是一條培育雄性不育新種質行之有效的途徑。

通過原生質體融合可以克服遠緣雜交不親和性，轉移野生品種的抗逆性。花椰菜生產中常常遭受病蟲害的威脅，而現有育種材料中存在的抗病、抗逆基因，由於長期的人工培育定向選擇已日益狹窄，遠不能滿足進一步提高品種對病害及逆境多抗性的需要。增強對野生材料優異抗性基因的利用，是進一步創新育種基礎材料的有效途徑。蔬菜野生類型在長期自然選擇下形成了高度的抗病性，通過與野生類型進行遠緣雜交，可以大幅度提高現有品種的抗病性和抗逆性，但是遠緣雜種通常表現不親和性，嚴重限制了其在品種改良中的應用。利用原生質體融合技術得到的不對稱雜種可以克服遠緣雜交不親和性轉移野生種抗性。姚星偉（2005）利用原生質體非對稱融合技術向花椰菜中轉移野生種抗逆性狀（供體Brassica spinescens具有光合效率高，抗白銹病、蚜蟲、黑斑病和耐鹽等優良特性），試驗共獲得17株雜種，其抗逆性在進一步鑒定中。可以看出，育種工作者越來越重視野生資源的發掘利用，生物技術中的細胞工程與分子生物學手段相結合是現階段利用野生資源的有效途徑。

利用原生質體融合技術可以轉移某些品種優良品質性狀，為改良花椰菜的營養品質提供新的途徑。蔬菜的高產、優質一直是人們所追求的目標。P.S.Jourdan（1989）利用花椰菜與具有除草劑抗性的Brassica napus進行原生質體融合試驗，獲得了具有高抗除草劑特性的雜種植株。B.Navratilove等（1997）以花椰菜和抗根瘤病的Armoracia rusticana為試驗材料，利用原生質體融合技術，獲得了花椰菜與Armoracia rusticana體細胞雜種植株。Hu（2002）用Brassica napus和具有亞油酸和軟脂酸含量高的Orychophragmus violaceus進行體細胞融合試驗，通過原生質體融合試驗得到的雜種植株不但亞油酸和軟脂酸含量升高，而且芥子酸的含量明顯下降，顯著改善品種品質。

2.分子標記技術與花椰菜種質資源創新

利用易於鑒定的遺傳標記輔助選擇是提高選擇效率和降低育種盲目性的重要手段。近20年迅速發展起來的分子標記技術給作物育種提供了新的途徑。運用DNA分子標記可以進行早期選擇，提高選擇的准確度和育種效率，有助於縮短育種周期。

（1）利用分子標記技術篩選自交不親和系 自交不親和性是高等植物為實現異花授粉受精和遺傳重組而形成的一種重要的遺傳特性，國內外學者對自交不親和性的遺傳機製做了大量研究。據Lewis（1979）報道，已在74個科的被子植物中發現了自交不親和性。國內利用分子標記技術篩選自交不親和系的研究也有所報道，黃聰麗（2001）應用RAPD分析方法，得到了與花椰菜自交不親和性相關的差異片段。宋麗娜（2005年）運用RAPD和ISSR分子標記技術，分離到鑒別自交不親和性的連鎖標記。

（2）利用分子標記技術鑒定抗病種質資源 張峰（1999）利用AFLP技術在一對花椰菜抗、感黑腐病的近等基因系中篩選到4個與抗黑腐病基因緊密連鎖的標記。劉松（2002）用天津科潤蔬菜研究所抗黑腐病近等位基因系C712和C731作為材料，篩選出與花椰菜抗黑腐病基因RXC連鎖的RAPD標記OP224/1600，將其轉化成更加穩定的SCAR標記，可快速准確篩選抗病材料。古瑜（2007年）以花椰菜抗病和感病近等基因系為實驗材料，對花椰菜抗病和感病近等基因系基因組進行了ISSR分析，得到3個與抗病基因有關的分子標記ISSR11000、ISSR21500和ISSR18700，可進一步應用於分子標記輔助育種。此外，利用cDNA-AFLP技術對致病菌脅迫的花椰菜抗黑腐病系進行差異表達分析，初步得到一個與抗黑腐病相關的基因片段，並證實該片段是受誘導的與誘導系統抗性（ISR）信號傳導有關的基因片段。此外，利用同源序列候選基因法和NBS profiling方法，在抗病系中得到2個抗病基因同源序列RGA330-7和NBS5-100，序列分析表明這兩個片段可能與花椰菜抗黑腐病基因有關。進一步將兩個RGA推測的蛋白序列與7個已知植物抗病基因的蛋白序列進行比較，構建了分子進化樹。聚類結果表明，本研究得到的兩個RGA片段應屬於non-TIR-NBS-LRR型。最後，利用表觀遺傳學的分析方法，對致病菌脅迫前後基因組中胞嘧啶甲基化水平和甲基化模式的變異進行分析，從基因表達調控的角度探討了抗黑腐病的分子機制。

（3）利用分子標記技術檢測遺傳變異 突變既可以發生在整個基因組，也可以發生於特定的基因或基因簇、結構基因、調節基因，以及單個核苷酸等。突變既可以自發也可以人工誘變在不用誘變劑處理的培養植物細胞中，突變體頻率一般為10-5～10-8，用誘變劑處理，可增至10-3，但誘變劑常會引起育性降低等副作用。Leroy（2000，2001）等利用花椰菜下胚軸進行組織培養，用ISSR方法檢測了愈傷組織形成過程、胞增殖過程以及成苗後的再生植株等各階段的植株間多態性，認為組織培養誘導的再生植株具有遺傳多態性，證明組織培養可誘發與篩選遺傳變異。

（4）利用分子標記技術篩選花椰菜雄性不育種質資源 植物雄性不育是一種不能產生有活力花粉的遺傳現象，在植物界中廣泛存在，目前已在43科162個屬320個種的617個品種或種間雜種中發現了雄性不育現象，它在作物雜種優勢利用上具有重要價值。

Chunguo Wang（2006）以花椰菜雄性不育品種NKC-A和恢復系NKC-B為材料，利用引物P6+/P6-進行PCR擴增，發現了一條300bp的差異片段，此片段可以作為鑒別雄性不育系的分子標記。王春國（2005）利用同源序列的候選基因法，通過檢索NCBI核酸以及蛋白資料庫，獲得花椰菜kndx612細胞質雄性不育相關的基因或開放讀碼框，初步結果顯示試驗所用不育花椰菜胞質亦可能為Ogura型，為進一步從分子水平研究和利用花椰菜雄性不育基因提供了條件。

（5）花椰菜遺傳連鎖圖譜的構建及在育種中的應用 遺傳連鎖圖譜是指以染色體重組交換率為相對長度單位，以遺傳標記為主體構成的染色體線狀連鎖圖譜，分子標記遺傳連鎖圖表示各標記所對應的DNA片段在染色體上的相對位置，是分子標記運用於作物遺傳育種的基礎，構建分子標記連鎖圖的理論基礎是染色體的交換和重組。自1986年以來，主要農作物都已建立了以RFLP為主的分子遺傳圖譜，分子標記連鎖圖，是進行基因定位、基因克隆、輔助選擇進行作物設計育種的技術平台。在遺傳學理論、功能基因組學以及遺傳育種等領域已顯示出了十分重要的作用。

Li（2001年）等利用SRAP、AFLP技術對86個羽衣甘藍×花椰菜的RI作圖，此圖由130個SRAP標記和120個AFLP技術構成，這些標記非常平均地分布在9個連鎖群，覆蓋2165cM。古瑜（2007年）利用AFLP和NBS profiling兩種方法，以花椰菜品種間雜交F2代為作圖群體，構建了第一張花椰菜遺傳連鎖圖譜。該圖譜包括9個連鎖群，連鎖群的總長度為668.4cM，相鄰標記間的平均圖距為2.9cM，在所包含的234個AFLP標記和21個NBS標記中NBS標記分布於8個連鎖群且在基因組中成簇排列。該圖譜通過提供可能的抗性基因位點，對進一步得到抗性基因很有幫助。同時研究RGA在整個花椰菜基因組中的分布與組成，也為了解抗性基因的分布與演化提供參考。進一步可用於分子標記輔助育種。

（6）花椰菜不同花色種質資源的創新 近年來，利用基因工程技術已經獲得了許多傳統園藝技術難以獲得的新品種，如紫色、白色以及紫白相嵌的3種不同顏色的矮牽牛花。而這些技術通常要求對相關基因有所了解，以獲得目的基因的cDNA，然後將這些外源基因導入目標植物中，達到改變花色、花型等目的。Crisp等利用遺傳上一致的白色花球品種和綠色品種雜交，從雜交後代遺傳表現提出一種模型：Wiwi基因控制白色對黃色是顯性，非獨立共顯性基因gr1gr2表現為綠色。Dickson報道了在埃及引進的花椰菜品種PI 183214，即便完全暴露於陽光下，花球也是純白色的。並認為是由2或3對顯性基因控制的。Singh等報道了由兩對基因控制的可以遮蓋住花球的葉片，以防止陽光照射引起的花球變色。李凌等（2000）對花椰菜黃花和白花的近等基因系進行了研究，篩選到了一個白花株系的特異帶，通過Northern點雜交初步鑒定其為白花株系所特有，同時利用Smart cDNA-AFLP銀染技術對花椰菜黃花近等基因系的mRNA進行了分析，其中2對引物的3條帶在2個表達基因文庫之間存在多態性，其中一條與白花品系共分離；篩選到一條白花株系的差異片段，本研究為克隆與花色相關基因奠定了基礎。

3.轉基因技術與花椰菜種質資源創新

轉基因技術的發展對加速創新花椰菜種質資源具有重要意義。目前，已育成一大批雄性不育、抗病、抗蟲、品質優良的花椰菜新品種，並產生了很大的社會和經濟效益。

（1）花椰菜雄性不育種質資源創新 近年，花椰菜雄性不育研究取得了進展，已從中找出一些與不育相關的基因或者嵌合體。這對進一步闡明花椰菜雄性不育發生的分子機理，指導新不育系的培育打下了基礎。Bhalla（1998）把與花粉相關的基因Bcp1整合到質粒PBI101中，通過根瘤農桿菌介導轉入花椰菜子葉中，獲得了50%花粉不育的花椰菜不育新種質。

（2）花椰菜抗病蟲種質資源創新 在花椰菜抗病基因的克隆和轉移方面也有報道，張桂華等（2001）以花椰菜栽培品種「春秋」為試驗材料，在攜帶CaMV Bari-1基因Ⅵ的根瘤農桿菌菌種GV3101的介導下，獲得了經篩選轉化的花椰菜轉基因幼苗，為培育抗花椰菜花葉病毒型品種提供可能。

花椰菜轉基因抗蟲研究中最常用的外源基因有兩種：內毒素（Bt）基因和豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）基因，這兩種基因已經成功轉入花椰菜中，為利用轉基因技術創新花椰菜種質資源提供了寶貴經驗。

華學軍（1992）、蔡榮旗（2000）、徐淑平（2002）、周煥斌（2003）等都利用農桿菌介導將Bt基因轉入花椰菜中，成功獲得了轉基因植株。

CpTI基因屬於Bowman-birk型絲氨酸蛋白酶抑制劑，能抑制包括鱗翅目、鞘翅目、直翅目等多種害蟲中腸中胰蛋白酶的活性，具有廣譜抗蟲性。呂玲玲（2004）通過根瘤農桿菌介導，將豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）基因整合到花椰菜植株的基因組中，對鱗翅目蟲害青蟲的生長發育有一定的抑製作用。徐淑平（2002）用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法將Bt基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI）導入花椰菜，獲得了轉基因花椰菜植株。Ding（1998）等利用農桿菌介導，從當地甘薯中分離得到的抗蟲基因TI轉入花椰菜中，結果表明，轉基因植株比對照植株抗蟲效果明顯。

（3）與花椰菜花球性狀有關的突變基因的研究進展 Bowman（1993）等首先在擬南芥中發現了花球突變體cauliflower。隨後Kempin SA（1995）等從擬南芥中分離得到兩個與花的分生組織活性有關的CAULIFLOWER和APETALA1基因，研究表明：其功能為轉錄因子。同時對花椰菜栽培種中該基因的同源基因研究發現：花椰菜中其同源基因是無功能的。這暗示了花椰菜肉質花序形態的形成機理與該基因密切相關。Purugganan（2000）等研究了野生型和栽培型花椰菜中CAL基因的多態性，發現野生型和栽培型CAL基因存在差異，栽培型花椰菜中該基因的第五個外顯子有一個等位基因位點發生了突變。Lee B.Smith（2000）以BoCAL和BoAP1兩個隱性等位基因在特殊位點上的分離為切入點，研究了花椰菜花球的起源和進化過程，得到花球發育的遺傳模式，認為：BoCAL-a等位基因與離散花序的形態之間存在很強的相關性。以上的結果都表明：CAL基因的突變抑制花分生組織發育，這是花椰菜花球形成的遺傳基礎。趙升等（2003）、曹文廣（2003）、李小方（2000）通過把甘藍BoCAL基因轉入花椰菜中，轉基因花椰菜不能形成花球，證實外源基因BoCAL能夠部分補償花椰菜BobCAL基因功能的喪失，部分恢復花椰菜的花球表型。因此可以通過控制BoCAL基因的突變程度和基因的表達水平，調節花球的發生時間和發育速度，從而為培育結球緊實度高的花椰菜新品種提供新的途徑。

在生產實際中，花球採收後，其內源激素和營養成分的變化造成內在品質逐漸降低，嚴重的影響產品的商品性和食用的營養價值。花球的衰老首先出現在萼片的葉綠素喪失。乙烯的合成與葉綠素的喪失以及隨後的黃化成因果關系。ACC氧化酶（ACO）是乙烯合成的一個限速酶，並且ACO基因的表達調控著乙烯的生成速率。從基因上對ACO基因的表達進行調控，可延緩乙烯的生成，這已經在許多作物上獲得成功。陳銀華（2005年）根據親緣關系較近的幾種作物ACC氧化酶氨基酸序列，設計一對簡並引物，從花椰菜基因組中獲得長1202bp的候選片段，並獲得花椰菜抗衰老的新材料。

Ⅷ DNA銀染方法的優化

DNA銀染檢測方法的改進
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【英文篇名】 Improvement of DNA Silver Staining Detection
【作者中文名】 李天翊; 張運峰; 范永山;
【作者英文名】 LI Tian-yi; ZHANG Yun-feng; FAN Yong-shan（Department of Life Science; Tangshan Teachers College; Tangshan Hebei 063000; China）;
【作者單位】 唐山師范學院生命科學系;
【文獻出處】 唐山師范學院學報, Journal of Tangshan Teachers College, 編輯部郵箱 2009年 05期
期刊榮譽：ASPT來源刊 CJFD收錄刊
【關鍵詞】 PAGE; 銀染; DNA檢測; 影響因素;
【英文關鍵詞】 PAGE; silver staining; DNA detection; influencing factors;
【摘要】 DNA的聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測技術是分子生物學實驗中的一個難點。對點樣量、固定時間、顯色時間等因素進行了改進和優化,收到了較好的實驗效果。
【英文摘要】 Silver staining for DNA polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) is one important but difficult technique in Molecular Biology.The influencing factors,inculding the quantity of sample application,stationary time,and imaging time,were optimized for the PAGE/silver staining technique.The good experimental results showed that the improved method was feasible and available.
【DOI】 CNKI:SUN:TSSF.0.2009-05-022

Ⅸ 急求！！DNA測序的問題

DNA測序技術
DNA sequencing technology
在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，產生 A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。
Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、 A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X- 光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

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一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03-- 2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
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二、材料
待測已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。
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三、設備
高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR儀。
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四、試劑
（1）SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
（2）丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺儲備液（38%丙烯醯胺 W/V，2%甲叉雙丙烯醯胺 W/V)：95g丙烯醯胺，5g甲叉雙丙烯醯胺溶於140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾後，貯於棕色瓶中，置於4℃冰箱可保存2周。
（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶於4ml水中，定容至5ml，應新配新用。
（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶於雙蒸水中定容至1升，置於4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配製2升備用。
（8）染色溶液：硝酸銀2克，甲醛3ml，溶於2升超純水中備用。
（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶於2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
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五、操作步驟
：
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，並且注意如下幾點：
（1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA一起電泳。
（2） 分光光度法對於很多DNA提取物包括質粒小量制備來說，並不能給出一個可信的DNA濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA濃度。
（3） DNA制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳後DNA樣品的前面，並不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。
（一）測序反應：
1. 對於每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。
2. 對於每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對於每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350鹼基的長度。
7. 熱循環程序完成後，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
[注意] 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 模板量
200bp (PCR產物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由於超螺旋質粒產生的信號比鬆弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物鹼基數
計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基對數
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基數
3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用於引物<24鹼基或GC含量<50%
95℃ 2分鍾。然後： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鍾(延伸)。
模式2:適用於≥24鹼基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鍾, 然後: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之後樣品可在4℃保存過夜。
（二）、 測序凝膠板的制備
1、玻璃板的處理：
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最後用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯於玻璃板上。這一步對於在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。
B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。
C. 4-5分鍾後, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然後略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多餘的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。
2. 准備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導致凝膠撕裂。
(2)、長玻璃板的處理
A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
B. 5-10分鍾後用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多餘的Sigmacote溶液。
[注意] 1. 用過的凝膠可在水中浸泡後用剃須刀片或塑料刮刀颳去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡後除去。為防止交叉污染, 用於清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現交叉污染, 以後制備的凝膠可能撕裂或變得鬆弛。
2、凝膠的制備：
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理後，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置於玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓於其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配製過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，並用0.45mm的濾膜過濾，然後加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻後，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制後4-6分鍾，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的 TEMED和過硫酸銨。
凝膠終濃度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)膠配製好後，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完後，靜止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。
（三）電泳：
1、預電泳
（1）當凝膠聚合完全後，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板後，方能加入TBE緩沖液。
（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源准備預電泳。
（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃後進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
（5）按30V/cm的電壓預電泳20-30分鍾。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
[注意]
（1）. 用鯊魚齒梳製作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。
（2）. 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。
2、樣品的制備：
當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鍾，立即置於冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4- 6%聚丙烯醯胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小於0.4mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。
3、上樣及電泳
關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然後立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、 T、C。加樣完畢後，立即電泳。開始可用30V/cm進行電泳，5分鍾後可提高至40-60V/cm，並保持恆壓狀態。一般來說，一個55cm長， 0.2mm厚的凝膠板，在2500V恆壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可採用兩輪或多輪上樣。
[注意]
1、上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到後才能上樣電泳。
2、一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的解析度降低，並且使帶擴散。電泳中可進行恆功率電泳。
（四）、 測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
1. 電泳完畢後用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振盪20分鍾或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振盪)。保留固定/停止溶液，用於終止顯影反應。
3. 洗膠：用超純水振盪洗膠3次，每次2分鍾。從水中取出, 當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。
4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鍾。
5. 凝膠顯影：
(1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配製。
(2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長於5-10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻將凝膠轉移至1升(總量的一半)預冷的顯影液充分振盪直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2--3分鍾,或直至所有條帶出現。
6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應,固定凝膠。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鍾，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
8. 將凝膠置於室溫乾燥或用抽氣加熱法乾燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
[注意] 測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響。
1. 水的質量對於染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質, 則低分子量條帶可能無法出現。
2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結果。
3. 染色後的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA, 產生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。
4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯醯胺濃度高於4-6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4mm薄，染色反應後的洗滌必須縮短至不超過5秒。
5. 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10-12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶液。