❶ 如何篩選和鑒定生物標本中差異表達的蛋白分子
目前篩選差異表達基因的方法主要有差異顯示PCR方法 (differentialdisplayRT PCR ,DDRT PCR)、消減雜交法 (subtractivehybridization ,SH )、基因晶元技術 (DNAchiptechnique)和基因表達的系統分析 ( ,SAGE)等 ,其中消減雜交法中又先後建立了代表性差異分析技術 ( ,RDA)、抑制消減雜交法 ( ,SSH)和獲得全長基因的消減雜交法 (full length gene ) .篩選差異表達蛋白質的方法主要有雙向電泳技術(two dimentionalgelelectrophoresis)和噬菌體全套抗體庫技術 ()
❷ 誰來介紹下phage display技術
一、單鏈絲狀噬茁體展示系統
1．pIII展示系統及噬苗體抗體
絲狀噬茵體是單鏈DNA病毒，pIII是病毒的次要外完蛋白(minor coatprotein)、位於病
毒顆粒的一端，每個病毒顆粒都有3—5個拷貝pIII蛋白，pIII有兩個位點可供外源序列插入，即N端和近N端可伸屈胃內。當抗體片段或蛋白質融合到PIII的N端時，噬菌體仍有感染性，但若融合到後一位點則會切去N端而喪失感染性，這時就需有輔助噬菌體提供野生型pIII蛋白。PIII很容易為蛋白水解酶水解。所以有輔助噬菌體超感染時．可以使每個噬菌體平均顯示不到一個融合蛋白，即所謂「單價「噬茵體，從而使抗體部分最大限度地保持原構型而功能完好。
PIII展示系統的主要用途是制備噬茵體抗體，它的突出優點是模擬了自然免疫選擇系統。自然免疫系統(immune system)(immune system)中．抗原結合於B細胞表面受體而使其活化並分裂增殖、分化成有抗體分泌功能的漿細胞。這個過程可以從約5×109個鼠細胞和約1012人細胞中選出一個至幾個特異B細胞，並有選擇性地富集特異性B細胞，通過多輪突變和選擇使抗體親和力成熟。pIII展示系統完全模擬了自然選擇系統；噬菌體展示的抗體片段可以由抗原包被的板、柱等選擇，或者用生物素標記的抗原從液相中捕獲。結合在固相抗原的噬茵體抗體經洗滌後可用可溶性半抗原、酸、鹼等洗脫，然後感染大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)培養擴增，再經下一輪的「吸附—洗脫—擴增」篩選。首輪篩選可使特異性噬菌體富集20一1000倍，一般經4輪篩選，可富集107倍。對初步篩選的抗體，可以用錯構酶及PCR鍺配技術等實行多輪突變或採用鏈置換法使其親和力成熟。
用P III系統制備抗體的基本程序是：從經免疫或未免疫者獲取淋巴細胞(外周血淋巴細胞，或脾、淋巴結、骨髓等的淋巴細肥)，提取細胞mRNA(或細胞基因組DNA)，逆轉錄成cDNA，用PCR方法擴增抗體重鏈和輕鏈基因，若制備ScFv抗體片段，還需設計接頭Linker，如（Gly4—Ser），做成VH—Linker—VL連接)。將擴增的抗體基因克隆到絲狀噬茵體載體中，若欲制備ScFv抗體，則克隆VH—Linker—VL基因，若制備Fab抗體、則可將VHCHl基因克隆入λ菌體載體，輕鏈基因克隆入PASK22類型載體中，在大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)共表達，或將二者克隆入同一噬茵體載體中進行表達。P III展示系統的載體，在抗體基因與P III蛋白之間插入了一個琥珀中止密碼(amber stop codon)，當此密碼受抑制時抗體片段就展示在噬菌體表面，當此密碼不受抑制時抗體則分泌。因此在抑制型和非抑制型大腸桿菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)中培養重組噬菌體時就分別模擬了B細胞表面呈現抗體SmIg和漿細胞分泌抗體的功能。已有用P III展示系統成功地篩選到高親和力特異性抗體的報道。
與雜交瘤技術相比，pIII展示系統篩選范圍從幾千擴增到幾百萬甚至幾億．而時間可以從幾個月縮短到幾周，它不但繞過了繁瑣的雜交瘤技術．甚至可以繞過免疫，而且可以直接獲取人源性抗體，解決了鼠單抗應用於人體免疫原性問題。
2．PVIII及其它展示系統
PVIII是絲狀噬茵體主要衣殼蛋白(major Coat protein)，每個病毒顆粒有3000拷貝pVIII蛋
白。PVIII的N端附近可融合五或六肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多聚蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬茵體參與時，可提供野生型pVIII蛋白．降低價數，此時可融合多肽甚至抗體片段。
二、λ噬茵體展示系統
1，pV展示系統
λ噬菌體的主要尾部蛋白P v可供外源序列插入。λ噬菌體基因V編碼的主要尾部蛋白
形成管狀結構，由32個盤狀結構組成，每個盤狀結構又由6個Pv亞單位組成。Pv有兩個折疊區〔fo1ding domain)，C端的折疊區是病毒的非功能區，可供外源序列插入或替換。Maruyama等用p v系統成功地展示了有活性的大分子蛋白：β—半乳糖苷酸(465KD)和植物外源凝集素BPA(120KD)。DNA結合蛋白、放多細胞質蛋白若融合進絲狀噬菌體，將相互干擾由細菌細胞質到周質腔分泌的通道，而用λ噬菌體使其在細胞質中完成折疊，無需分泌，因此避免了這一干擾。λ噬菌體還可以展示難以分泌的肽或蛋白質，因此可作為絲狀噬菌體展示系統的補充。
2．D蛋白展示系統。
D蛋白是λ噬菌體頭部組裝必需蛋白，分子量11KD。λ噬茵體顆粒的兩個結構單位頭部和尾部是分別組裝的。在頭部組裝過程中先形成支架狀前頭，然後水解加工成前頭，當DNA進人頭部以後，D蛋白附著於病毒衣殼的外側、將噬茵體頭部鎖住，使之圍繞DNA就位，因此正常情況下，D蛋白在噬茵體頭部形態發生上是必需的。但是當噬茵體基因組小於野生型基因組的82％時，它可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體。這種展示一般為N端展示。它的組裝可以在體內，也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結合到λD—噬菌體表面，而體內組裝是將含D融合基因的質粒轉化入λD—溶源的E．Coli菌株中從而補償溶源茵所缺的D蛋白，通過熱誘導而被組裝，或利用噬菌體P1的Cre—loxP定點重組系統將外源基因整合進入噬茵體基因組中。
D蛋白展示系統的特點：因為是在病毒細胞內完成組裝．無需將外源肽或蛋白分泌到細
菌細胞膜，可以展示對細胞有毒性的蛋白。另外，D蛋白展示系統還可以用於cDNA文庫的構建，抗原位點分析及作為基甲輸送工具。Mikawa等對D蛋白的基因進行了改
造，使外源序列在D蛋白的N端和C端都能插入，並成功地表面展示了有活性的葡萄球菌A蛋白IgG結合域、β—半乳糖昔酶和β—內醯胺酶。
三、T4噬茵體展示系統。
T4噬菌體展示系統是將外源肽或蛋白質與T4噬菌體的小外衣殼蛋白(small outer capsid
protein SOC)C端融合而被展示。如SOC是一個分子量為9KD的小蛋白，是T4衣殼組裝非
必需的，而且不論在體內還是體外，它都具有與成熟衣殼表面特定位點高親和力地專一結合
的能力，T4噬菌體是在宿主細胞內組裝而不必通過分泌途徑，因此可以展示的敗或蛋白質
范圍廣，尤其適用於展示那些不能被E．coli分泌的復雜蛋白質。
目前已成功地利用該系統展示了HIV—1病毒被膜糖蛋白gpl 20的v3環狀結構域和脊
髓灰質炎病毒VPl衣完蛋白(312肽)，兩者均能形成正確的折疊結構。由於該系統容量大
(至少35KD的蛋白質)、拷貝數高，故在完整結構域或蛋白質的免疫學展示、蛋白質與蛋白質問相互作用的研究及生物工程學方面有相當大的應用潛力。
現在有研究報道利用E.coli的脂蛋白、鞭毛蛋白展示外源蛋白。但是相對而言，革蘭氏陽性菌比陰性的有優越性：G+細菌表面受體比G—細菌更易接受外源序列的插入；G—細菌展示系統的表面展示要穿過整個細胞質膜，需要膜上的正確整合過程，而G+細菌展示系統只需穿過單層膜就可以實現理想的展示；以細菌全細胞作為診斷或Panning實驗，從巨大文庫中篩選特異性細菌克隆的實際操作中，因為G+細菌有較厚的細胞壁(cell wall)(cell wall)，不容易在各種實驗過程中發生細胞溶解。
回復:
❸ 簡述檢測蛋白質磷酸化的檢測方法及其原理
方法及原理：
1.激酶活性分析
生物學樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉澱的激酶與外源底物共同孵育。之後通過一些報告系統來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。
直接測定蛋白磷酸化的一種經典方法是將整個細胞與放射性標記的32P-磷酸鹽共同孵育，獲得細胞提取物，通過SDS-PAGE分離，並曝光在膠片上。這種繁瑣的方法需要多次幾小時的孵育，且使用放射性同位素。其他傳統方法包括2D凝膠電泳，這種技術假定磷酸化會改變蛋白的遷移率和等電點。
2.WesternBlot
利用SDS-PAGE分離生物樣品，隨後轉移到膜上（通常是PVDF或尼龍膜），之後利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。
由於測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，研究人員常常利用一個抗體來檢測同源蛋白的總水平（而不考慮磷酸化狀態），以確定磷酸化組分相對於總組分的比例，並充當上樣內對照。化學發光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來提供蛋白分子量的信息。
3.酶聯免疫吸附分析（ELISA）
ELISA的定量能力優於Westernblot，且在調節激酶活性和功能的研究中表現出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態無關。隨後讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復雜的異質樣品（如細胞裂解液）中的一個組分。加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些分析通常設計為顯色或熒光檢測。
4.基於細胞的ELISA
來自目的蛋白的信號可通過第二種蛋白來標准化，校正各孔之間的差異，實現磷酸化蛋白水平的准確評估，並比較多個樣品，與傳統免疫印跡中使用磷酸化特異和總蛋白抗體相似。這些分析繞過了制備細胞裂解液的需要，因此更適合高通量分析。
5.質譜
首先，磷酸化肽段的信號通常較弱，因為它們帶負電荷，而電噴霧質譜在正電模式下作用，因此電離效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很難觀察到低豐度目的蛋白的信號。
6.多個分析物圖譜分析